一、实验目的

    1、了解普通光学显微镜的构造、基本原理、维护和保养的方法。

    2、掌握普通光学显微镜的正确使用方法。

    二、实验原理

    普通光学显微镜的构造

    (一)普通光学显微镜的机械装置

    1、镜座：是移动显微镜的把手，其作用是支撑整个显微镜。有的显微镜的镜座内还装有反光镜和光源组。

    2、镜臂：是移动显微镜的把手，它支撑和固定镜筒、载物台及调焦装置。直筒显微镜的镜臂与镜座连接处有活动关节，可按需要将镜臂调节至适当倾斜度。

    3、镜筒：是显微镜上方的空心圆筒，其内喷以无光黑漆(避免光线乱反射)，上端套接目镜，下端与物镜转换器连接。镜筒有单筒和双筒两种。单筒可分为直立式和倾斜式两种；双筒都是倾斜式的。双筒镜筒有调距装置，可调节两镜筒之间的宽度，其中的一个镜筒上还装有视度调节。镜筒上缘到物镜转换器螺旋下端的距离称为镜筒长度或机械长度。调节式镜筒附有刻度，一般可调范围为155-250毫米；固定式的为160或170毫米。

    4、物镜转换器：连接于镜筒的下端，其上有3-4个圆孔，可顺序安装不同倍数的物镜，使用时?据需要转动转换器来更换观察用的物镜。

    5、载物台：亦称工作台，固定在镜臂上，方形或圆形，中央有一通光孔，台面上装有推进器和?簧?，可推动和固定标本。有的显微镜在载物台两边或一边(或在推进器上面，或在载物台下面)装有两个移动手轮，转动移动手轮可使载物台前后左右移动，便于观察标本的任一视野。有的显微镜在载物台的纵向和横向上装有游标尺，可测定标本的大小，也可用来对被检视野作标记，以便下次观察时再检查该视野。ZXCI普通光学显微镜的标本移动器的横向移动范围为60毫米，纵向移动范围为25毫米，游标格值0.1毫米。

    6、调焦装置：安装在镜臂的两侧，与镜筒或载物台连接。调焦装置包括粗动调焦手轮和微动调焦手轮，转动调焦手轮可使镜筒或载物台上下移动，以调节焦距，使标本与物镜的距离等于物镜的工作距离。ZXCI普通光学显微镜的粗微动调焦范围为15毫米，微动调焦格值为0.002毫米。1.目镜；2.镜筒；3.镜臂；4.玻片?；5.游标卡尺；6.粗准焦螺旋；7.细准焦螺旋；8.底座；9.光源；10.虹彩光圈；11.聚光器；12.载物台；13.物镜；14.转换器

    (二)普通光学显微镜的光学装置

    1、目镜：也称接目镜，安装在镜筒的上端。目镜的作用是把物镜放大的实像进一步扩大。目镜由上下两组透镜组成，上面的叫接目透镜，下面的叫会聚透镜。上下透镜之间装有一个光阑。光阑的大小决定视野的大小。目镜的光阑上还可以放置测微目尺。显微镜通常配备有10倍、16倍等几种目镜。

    2、物镜：也称接物镜，安装在物镜转换器上，物镜的作用是把标本作第一次放大。

据需要时的条件不同,可以把物镜分为干燥物镜(包括低倍物镜和高倍物镜)和油浸物镜.干燥物镜在使用时,标本片与物镜之间的介质是空气.干燥物镜按放大倍数还可以分为低倍物镜、中倍物镜和高倍物镜.一般把10倍以下的物镜叫低倍物镜,把20倍的物镜叫中倍物镜,40-45倍或60倍的物镜叫高倍物镜.这些物镜上标有5×、10×、20×、40×、45×、60×.油浸物镜是物镜中放大倍数最高的镜头(90×或100×),使用油镜时,在标本上加一滴镜油作为介质.国产显微镜的油镜常标有"油"字,国外产品则常用"oil"(oilImmersion)或"HI"(HemcyeneousImmersion)字样,以供识别.物镜上通常标有放大倍数、数值孔径(亦称镜口率)、工作距离等主要参数.
    3、聚光器:也叫集光器,由聚光镜和可变光阑组成.聚光镜由一片或数片透镜组成,其作用相当于凸透镜,起聚光的作用,以增强射入物镜的光线.可变光阑也叫光圈,位于聚光镜的下方,由十几片金属薄片组成,中心部呈圆孔.推动可变光阑的把手可以任意调节孔径的大小,其作用是通过调节光强度,使聚光镜的数值孔径和物镜的数值孔径相一致.可变光阑开得越大,则数值孔径越大;反之,则数值孔径越小.

    4、反光镜:一般装在聚光器下方的镜座上,可以在水平和..直方向任意旋转.它的一面是平面镜,另一面是凹面镜,其作用是使光源发出的光或自然光射向聚光镜.光强时用平面镜,光弱时用凹面镜.有的显微镜的人工光源安装在镜座内,其反光镜也固定在镜座内.

    (三)普通光学显微镜的光学原理

    由单透镜构成的放大镜和由几..透镜组成的实体显微镜(解剖镜)称单式显微镜生物学教学及科研所用的光学显微镜一般是复式显微镜.

    1．光学显微镜成像的原理

    由外界入射的光线经反光镜反射向上,或由内光源发射的光线经集光镜向上,再经聚光镜会聚在被检标本上,使标本得到足够的照明,由标本反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾斜45度角的棱镜,在目镜的焦平面上,即在目镜的视场光阑处,成放大的侧光实像,该实像再经目镜的接目透镜放大成虚像,所以人们看到的是虚像(图1-l-2).

    2．显微镜的放大倍数

    被检物体经显微镜的物镜和目镜放大后的总放大倍数是物镜的放大倍数和目镜放大倍数的乘积.如用放大40倍的物镜和放大10倍的目镜的总放大倍数是400倍.

    3．分辨率

    物镜前面发光点发射的光线进入物镜的角度称开口角度.透镜的放大率与开口角度成正比,与焦距成反比.数值口径(又称开口率numericalaperture简写为NA)是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的正弦,乘上标本与物镜间介质的折射率的乘积.NA＝n×SinθNA为数值口径;n是介质折射率;θ为最大开口角度的半数.由于介质为空气时n＝1,最大值只能到90度(实际上不可能达到90度),Sin90＝1,所以干燥系下物镜的数值口径都小于l.使用油镜时,物镜与标本间的介质为香柏油(n＝1.515)或液体石蜡(n=1.52),不仅能增加照明度,更重要的是增大数值口径,目前技术下最大的数值口径为1.4.

  评价一台显微镜的质量优劣,不仅要看其放大倍数,更重要的是看其分辨率.分辨率是指显微镜能够辨别发光的两个点或两??细线间最小距离的能力.该最小的距离称为鉴别限度(R):

    R＝λ／2nSinθ＝λ／2NA

    R为鉴别限度;λ为光的波长.

    日光的波长λ＝0.5607μm≈0.6μm,如果用NA＝1.4的物镜,则

    R＝0.6／2×1.4＝0.22μm

    4．工作距离

    工作距离是指观察标本最清晰时,物镜透镜的下表面与标本之间(无盖玻片时)或与盖玻片之间的距离.物镜的放大倍数越大,其工作距离越短,油镜的工作距离最短、约为0.2mm,所以使用油镜时,要求盖玻片的厚度为0.17mm.虽然不同放大倍数的物镜工作距离不同,但生产厂家已进行校正,使不同放大倍数物镜转换时,都能观察到标本,只需进行细调焦便可使物象清晰.

    5．目镜的放大倍数

    ??据计算,显微镜的有效放大倍数是:

    E×O＝1000×NA

    E为目镜放大倍数,O为物镜放大倍数

    目镜的有效放大倍数是:E＝1000NA／O??据上式可知,在与物镜的组合中,目镜有效的放大倍数是有限的,过大的目镜放大倍数并不能提高显微镜的分辨率.如用90×,NA为1.4的物镜,目镜有效的最大倍数是15×.

    (二)相差显微镜的使用方法

    相差显微镜与普通显微镜??本相同,只是在普通显微镜上附加光阑和相板等相差滤光装1、环状光阑:是由环状圆孔构成的光阑,大小不同的环状光阑成一转盘,安装于聚光镜下面.更换放大率不同的物镜时,要同时更换与其适应的光阑.

    2、相板:装于物镜的后焦平面,有推迟直射光和衍射光相位,以及吸收光线收变亮度的作用.带有相板的物镜,称为相差物镜.

    3、合轴调整望远镜:为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上,必须拔出目镜,装上特制的低倍望远镜,使相板的暗环与环状光阑的明环合轴.

    其使用方法是在普通光学显微镜上换上相差聚光器和相差物镜,将用水封载的玻片标本放在载物台上,转动相聚光器,使与物镜的开口率或放大倍数相一致,镜检见物像.取下目镜,换上合轴调整望远镜,伸缩望远镜筒,使看清物镜相板上暗环和环状光阑上的亮环;移动彩虹光圈,使暗环和亮环圆心重合;升降聚光器,使两环完全重合,即在亮环内外侧看到暗的边缘.取下望远镜,换上补偿目镜进行镜检.镜检时只能以微动螺旋调焦而不能转动聚光器,否则需重新进行合轴调整.更换物镜时也要重新进行合轴调整,然后才能观察.相差显微术需用水作封载剂并加盖玻片.

载玻片和盖玻片厚度分别为1.0-1.2、0.17-0.18毫米,清洁无损.
    三、实验材料

    (一)仪器和其他物品

    普通光学显微镜、液体石蜡或香柏油

    (二)微生物材料

    枯草芽孢杆菌的染色标本

    四、实验内容

    显微镜的使用方法.

    (一)显微镜的放置

    显微镜应直立放置在案上

    (二)光源

    显微镜不能采用直射阳光.晴天可用近窗的散射光作光源.也可用日光灯作为光源.而专为显微镜照明而制造的聚丝电灯是较好的光源.

    在接通电源后,取下目镜,直接向镜筒内观察,并调节聚光镜上的孔径光阑,使其孔径与视野恰好一样大或略小于视野,其目的是使入射光展开的角度与物镜的数值口径(开口率NA)相一致,既可充分发挥该物镜的分辨力,又能把超过该物镜可能接受的多余光挡住,否则能产生干扰．影响清晰度.所以,原则上使用不同的物镜时应相应调节孔径光阑.放回目镜后,通过调节聚光器上的视??光阑或调节照明度控制钮,选择最佳的照明效果.

    (三)低倍镜和高倍镜的使用

    1．标本放置

    2．调焦

    转动粗调节螺旋,升高镜台(或下降镜筒)、使低倍物镜的前端接近载片,用左眼在目镜上观察,并转动粗调节螺旋,使镜台下降(或镜筒上升),可看到物像,然后转动细调节螺旋,使物假清晰.

    3．换高倍镜

    用低倍镜看到物像后,转动标本移动器上的螺旋,选择合适的视野,并把要观察的部位置于视野的中央,转动物镜转换器把高倍镜置镜筒下方.显微镜在设计制造时,都是共焦点的,即低倍镜对焦后,转换高倍镜时一般都能对准焦点,能看到物像,只需转动细准焦螺旋便可使物像清晰.通过调节集光镜上的视??光阑或照明度控制钮使获得最佳照明.

    (四)油镜的使用

    由于细菌个体微小,需要用油镜进行观察.

    1．滴加镜油

    转动粗调节螺旋,使镜台下降(或使镜筒上升)在染色标本处滴加1－2滴液体石蜡或香柏油.

    2．转换油镜

    转动物镜转换器,把油镜置镜筒下方.

    3．调焦

    转动粗调节螺旋,使镜台上升(或镜筒下降),让镜头的前端浸入镜油中.

操作时要从侧面仔细观察,只能让镜头浸入镜油中紧贴着标本而避免让镜头撞击载玻片,导致玻片和镜头损??.然后在目镜下进行观察,并缓慢??转动细准焦螺旋使镜台下降(或使镜筒上升)即可看到清晰的物像.
    转动细准焦螺旋使镜台下降(或使镜筒上升)时,若油镜已离开油滴,必须重新进行上述调节操作.不得边用左眼在目镜上观察,边转动细准焦螺旋使镜台上升(或镜筒下降)使镜头前端浸入油滴中,这样易使镜头撞击载玻片,损??标本和镜头.

    4．调节孔径光阑和视??光阑

    把孔径光阑开到最大,使与油镜的数值口径相??配,通过调节视??光阑和照明度控制钮选择合适的照明.

    5显微镜使用后的处置

    转动粗调节螺旋,使镜台下降(或使镜筒上升),取出染色标本玻片,然后先用擦镜纸接去油镜上的香柏油,再用擦镜纸沾少量二甲苯(不能用酒精)擦去沾在油镜上的镜油,最后用擦镜纸擦净二甲苯及镜油.用液体石蜡作镜油时,可以只用擦镜纸即可擦净,不必用(或仅用极少量)二甲苯.把镜头转成"八"字形,套上镜罩后放入显微镜柜中.

    (五)普通光学显微镜的维护

    显微镜是贵重精密的光学仪器,正确的使用、维护与保养,不但观察物体清晰还可延长显微镜的使用寿命.

    Ⅰ防潮:显微镜应放置在通风干燥,灰尘少,不受阳光直接曝晒的??方.不使用时有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来.也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内.最好还在镜箱内放一袋干燥剂(最常用的是变色硅胶,干燥的硅胶呈蓝色,吸潮后变为淡红色,淡红色硅胶烘干呈蓝色后,可继续使用).

    Ⅱ防尘:显微镜观察室内应保持清洁,尽量避免尘??.目镜和物镜如有尘污应用擦镜纸擦净.最好用塑料袋罩上并放入镜箱.

    Ⅲ防腐蚀:显微镜不要与挥发性药品及酸、碱类药品接触,以免受腐蚀.

    Ⅳ防热:显微镜不要放在日光曝晒,也不要放在靠近火炉、电炉或暖气片的地方.

    Ⅱ防震:从显微镜箱或柜内取出或放入显微镜时,应一手提镜劈,另一手托镜座,让显微镜直立,防止目镜从镜筒中脱落.

    Ⅵ保持清洁:显微镜的目镜、物镜、聚光镜和反光镜等光学部件必须保持清洁,防止长霉.镜检时通过转动目镜、物镜及调整焦距等措施判断灰尘或污脏所在的部位,如附有灰尘,则先用洗耳球??去灰尘,或用擦镜纸轻轻擦去.若有污脏,用擦镜纸或脱脂棉球沾无水乙醚7份和无水乙醇3份的混合液轻轻擦拭.然后用擦镜纸擦干.显微镜的金属油漆部件和塑料部件,可用软布沾中性洗涤剂进行擦拭,不要使用有机溶剂.