徕卡显微镜EM样品制备过程

由于在电子显微镜的对比度主要取决于在小区中的有机分子的电子密度的差异，污渍的效率是由附着在生物结构污渍的原子量来确定。 因此，使用Zui广泛的污渍在电子显微镜是重金属铀和铅。 尽管单独使用这些污渍中的一个可能是相当实用的常规用途中，当这两个污渍中使用的序列，“双反衬”，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，获得Zui高的对比度。

介绍

因此，在网格上以乙酸双氧铀和柠檬酸铅超薄切片的二重造影法的标准例程反衬技术用于电子显微镜。 虽然这种技术是众所周知的对比是样品制备用于电子显微镜中Zui关键的步骤之一。 除了人工处理，所用的化学品特别的属性，这可能会导致沉淀的人工制品，都是错误的因素。

醋酸双氧铀（UA），这增强通过相互作用的对比度与脂质和蛋白质，形成一个黄色的针状晶体析出，如果在右浓度，如果多余的UA不从部分除去未使用。 的柠檬酸铅，它通过与蛋白质和糖原相互作用增强了对比度，会形成水不溶性有毒的白色沉淀（碳酸铅），如果不是无二氧化碳排放的条件下严格使用。 避免的 CO 2中的手动过程是困难的其中一个特殊的过程是必要的。

再现性的科学需求，具有低试剂消耗在一侧和安全的工作条件通过避免与在另一侧的危险试剂接触的要求高品质的样品可被满足，以标准化的，封闭的和自动化的过程。

根据这些要求，徕卡显微镜开发的全自动徕卡EM AC20。 自动对比与现成的预包装UA和柠檬酸铅染色确保与试剂的Zui低用户联系，并消除了人工染色几乎所有的传统问题，如铀和铅的沉淀，健康风险和高试剂消耗。

渍

在电子显微镜中Zui广泛使用的污渍是重金属，铀和铅。 超薄切片用醋酸双氧铀（UA）和柠檬酸铅双重造影法的标准对比技术用于电子显微镜（图1和2）。

在本章中，我们将讨论UA的特点和柠檬酸铅及其优点和根据对比过程中的缺点。

图1：在水丝蚓属的环带区腺细胞颗粒。                    图2：水丝蚓属的纵向肌肉。

醋酸铀

UA（图3）的优点在于，它产生Zui高的电子密度和图像对比度，以及赋予细晶粒的图像由于铀238的原子量。 铀酰离子结合的蛋白质和脂质与唾液酸的羧基基团，例如糖蛋白和神经节苷脂和核酸的DNA和RNA的酸式磷酸酯基团。

图3：市售的黄

神经节苷脂是糖脂和集中在细胞的表面上。 糖蛋白中富含所有膜和多糖包的一部分。 因此UA传递膜，核酸以及含有蛋白复合物的核酸，如核糖体的良好的反衬效果。

从左至右依次为：醋酸根离子，铀酰离子，醋酸铀结构式

UA的缺点是它的光，特别是紫外线的灵敏度，并且将沉淀物如果暴露。 老化时，也沉淀。 此外，UA是既放射性和毒性。 从贫化铀制成的正常商业股有0.37-0.51微居里/克典型的放射性。 这是放射性的一个非常温和的水平，是不充分的有害同时该材料仍然是外部给体。 如果食入，吸入粉尘或皮肤接触，如果皮肤被切断或磨损是非常有毒的。 该毒性是由于化学毒性和轻度放射性的组合效应而存在的，从长期接触累积效应的危险。

醋酸铀解决方案

UA正在使用，也可以作为醇（乙醇或甲醇）或水溶液。 这两种类型的双氧铀溶液有个别的优点和缺点。

酒精醋酸铀

醇污点的优点是，它会更容易地渗透到塑料包埋的组织，从而得到高对比度，只需要很短的染色时间。

醇溶液的制备通常是在50％-70％乙醇或无水甲醇中的饱和溶液。

在甲醇中，得到Zui高的溶解度。 因此，可能的Zui高对比度由饱和甲醇乙酸双氧铀染色给出。 
酒精，特别是甲醇的醋酸双氧铀是化学侵蚀性的溶液。 因此，多孔材料的增强******应使用甲醇醋酸铀时予以考虑。 酒精UA溶解colloidin-parlodion支持膜，如果染色时间可以延长，甚至溶解膜聚乙烯醇缩甲醛。 它也有许多塑料和橡胶产生负面影响。

水醋酸铀

为了获得UA的污点的具体作用，它应当作为一个水溶液。

当UA正在溶解在水中，将溶液的pH值的范围为4.2至4.9视浓度（0.5％〜3％）。 在此pH下该双氧铀物质与正电荷支配和染色液给出一个足够的对比。 带负电荷的分子，如核酸，污点特别好。

水性污渍是不稳定的，也很光敏在此pH范围内。 老化的溶液和光照射的引线和四价铀的氢氧化物既铀氢氧化物沉淀。

四价铀也沉淀在某些有机离子，如包埋介质的未聚合的单体存在下，如下所示：

因为污渍具有较低的pH值，不推荐用于与样品是不稳定的在酸性条件下使用。 另外，色斑沉淀在生理pH下，在许多的盐和非常谨慎的存在下使用时是需要的。 因此，过滤的污点应在4℃下储存在暗处且可用于数个月。

稳定的解决方案

UA的稳定是必需的，以避免沉淀更长的存储时间。 沉淀可以在UA被酸化稳定完全避免。 酸化然而，大大降低了染色效果。 在pH 3.5铀离子的附着于DNA是强，也比在pH4.0更具体的，因为在该pH仅DNA具有负电荷。 在pH低于3.5双氧铀染色将反应非常弱的组织成分，因为大多数的蛋白质甚至核酸不再是在较低pH值下带负电荷。

徕卡Ultrostain我（醋酸铀溶液）

徕卡Ultrostain我对应于一个稳定的0.5％，pH为4.4乙酸双氧铀溶液。 它是预先装在棕色200毫升瓶以保护其免受光。 这是在一个特殊的风险实验室化学品生产厂，这是几乎不可能安排在一个EM-实验室条件下。

沉淀

在常规的对比过程，这些问题具有UA都比较容易被染色的反复更新，通过日常的过滤或离心分离来掌握。 在UA结晶在大正方形或菱形形成的晶体（或作为粒状骨料，图4）的针。

图4：醋酸铀沉淀

4％的制剂的含水醋酸双氧铀（重量/体积）原液

注意：醋酸铀是非常有毒的，由于化学毒性和轻度放射性的组合效应而存在的，从长期接触累积效应的危险。运动保健称量粉末，总是戴乳胶手套，实验服，防护面罩和其他适当的保护（接触实验室安全员！）

物料

• 乳胶手套，实验服，防护面罩

• 200毫升粗浆瓶（严格干净！）

• 百毫升容量瓶（严格干净！）

• 50毫升移液管（严格干净！）

• 在通风橱中的平衡

• 称量皿

• 热板

• 磁力搅拌器和搅拌棒

• 的Whatman＃1滤纸

• 玻璃漏斗

• 醋酸铀二水粉（贫）[U（C 2 H 3 O 3）2×2H 2 O]，4克

• 无二氧化碳排放双蒸水，125毫升

注意：一旦玻璃器皿被污染的重金属污渍它不应该被用于制备其它化学溶液。

程序

1. 权衡将4克醋酸双氧铀（UA）在通风橱下（磨损保护！），并将其添加到100ml容量的烧瓶中。 吸管96毫升近沸点的CO 2 -free双蒸水与UA的烧瓶中。

2. 放在搅拌器，直到醋酸铀水合物晶体溶解。 这将需要一段时间。 后溶解让溶液冷却至室温。

3. 通过的Whatman＃1过滤到200 ml棕色瓶（避光），并盖紧瓶盖和标签过滤器的UA。 此原液可存放数月，在4℃。

4. 冲洗受污染的玻璃器皿放入废瓶UA解决方案，并从实验室玻璃器皿单独存放。 被污染的UA固体废物应以固体废物的容器留出放射性废物处置（接触实验室安全员！）。

柠檬酸铅

柠檬酸铅增强了广泛的细胞结构，如核糖体，脂质膜，cytoskleleton和细胞质的其他车厢的对比效果。 的对比效果的提高依赖于具有降低的锇的相互作用，因为它允许铅离子的附接至分子的极性基团。 锇常规地用作固定剂。 柠檬酸铅也相互作用，在较弱的程度上，与UA，因此导致UA染色后柠檬酸染色使用。

柠檬酸铅的缺点是它的实验室条件和耗时细腻制备下不可预测的行为（参见图7）。 柠檬酸铅容易析出在二氧化碳的存在下，或者在空气中或在用于制备污渍或漂洗水。 碳酸铅（PbCO 3）是一种不溶于水的有毒的白色沉淀物，因此不会在漂洗水中溶解。 一般来说所有的铅盐如柠檬酸铅是剧毒的。

领先的解决方案

铅柠檬酸结构式

铅溶液的染色效果是高度相关的，如双氧铀溶液，在溶液的pH值。 不像铀，但是，它有可能使用含铅染色溶液在非常高的pH值（> 12 pH下）。

碱性Wenable＆Goggeshalls和雷诺的领先解决方案是Zui流行的。 通过这些方法，即雷诺（1963）更可靠的日常工作，仅仅是因为柠檬酸铅的商业品质并不总是符合要求的染色质量。 在雷诺数方法，柠檬酸铅形成为从柠檬酸钠和硝酸铅之间的反应产物。

所有的碱性铅污渍可以被认为是稳定的解决方案。 因此，这些解决方案是适合于商业处理，只要它们能消除碳酸铅形成的条件下进行。

徕卡Ultrostain II（柠檬酸铅溶液）

徕卡Ultrostain II对应于雷诺柠檬酸铅。 3％的柠檬酸铅溶液预氦气氛下真空密封袋包装。 这是根据极度小心完成在化学生产厂在一个特殊的风险实验室，并在其中是不能够实现在一个标准的EM-实验室条件。

沉淀

碳酸铅（PbCO 3）是一种不溶于水的有毒的白色沉淀物。

它显示为黑色颗粒的电子显微镜。 颗粒可以是大的（图7a）和少数或部分可被覆盖有细沉积物（图7b）。

图7A                                    图7B

注意：铅盐是剧毒的。 在加权粉末小心。 佩戴合适的防护。

物料

• 50毫升量瓶中，用塑料或玻璃塞（严格干净！）

• 25毫升移液管（严格干净！）

• pH计（严格干净！）

• 磁力搅拌器和搅拌棒

• 铅硝酸铅[Pb（NO 3）2]，1.33克

• 柠檬酸钠[娜3（C 6 H 5 O 7）×2H 2 O]，1.76克

• 无二氧化碳排放双蒸水，加入100毫升（新鲜制备并冷却到至少25℃）

• 1N的NaOH，将10毫升（以CO新鲜制备的2 -free双蒸水）

程序

1. 结合1.33克硝酸铅，1.76克柠檬酸钠和30ml无二氧化碳排放双蒸水在50ml的容量瓶中。 摇动溶液剧烈几分钟，然后5-6倍，在30分钟的时间。 这将产生铅染色的乳白色悬浮液，不含大的颗粒。 如果人们看到大段大段，继续摇，直到颗粒被分离，或重新开始。 搅拌在搅拌板上直到乙酸双氧铀水合物晶体（图3）被溶解。 这将需要一段时间。 后溶解让溶液冷却至室温。

2. 加5〜7毫升1N的NaOH，以悬浮液中，同时搅拌。 乳白色的解决方案应该把清晰。 如果没有，添加一些滴氢氧化钠高达总8毫升。 如果解决方案仍无法启动清楚，什么是错的污渍应该被丢弃！ 冲洗受污染的玻璃器皿放入废瓶UA解决方案和存储分离的实验室玻璃器皿。 被污染的UA固体废物应以固体废物的容器留出放射性废物处置（接触实验室安全员！）。

3. 撤回少量清晰染色并用pH计检查pH值。 pH值应为12.0 +/- 0.1。 如果pH值太低，添加更多的氢氧化钠向澄清溶液中步骤2的烧瓶中，如果pH高于12.1开始。

4. pH值已通过验证之后，无二氧化碳排放的水添加到量瓶中以使溶液于50 ml的终体积。 该瓶应严格塞住。

5. 该解决方案具有保质期可达6个月，如果封得严严实实。 在使用前，离心（5000×克/ 10分钟）或通道通过微。

注意：确切的pH值是这个污点极其重要的。 如果pH值超过0.1单位的pH从12.0变化，会发生染色差或沉淀。

对比过程

手册反衬

在标本电镜的准备，部分的手工染色，其中大部分故障都经历的步骤。 这里，栅格被置于乙酸双氧铀（UA）的溶液滴并除去后，在一定的温育时间与钳（图8a和8b）。 然后栅格被置于柠檬酸铅对孵化滴之前在水中冲洗几次（图9a和9b）。 为了防止柠檬酸铅通过暴露于CO 2的沉淀，氢氧化钠颗粒加入到染色皿中（此处的皮氏培养皿）中排除大气中的CO 2。 另外，漂洗水应CO 2 -free（双蒸馏）。 染色后，该网格中的几个热水浴中并且通过使用水（图9c）的射流再次漂洗。 芯吸和干燥后，网格可以被分析。

人工染色过程的主要问题是在金属的盐的在染色过程中的沉淀，特别是铅的沉淀。 NaOH颗粒的使用，以减少沉淀是一种常用的技术。 即使采用Zui佳的预防措施，析出可能破坏许多小时或工作甚至几天，临界半小时染色的过程中。

另一个被广泛经验的问题就是网格，可以很容易地破坏影片的支持，甚至部分的反复操作。

因为包括许多步骤的手工操作，在整个染色时间的用户的存在是必要的。 此外，当只有少量的网格可同时染色时，程序必须经常重复进行。 因此，人工染色大大有助于在EM实验室的工作负荷。 如果多个序列或长的连续切片的染色将被执行，特别是如果短染色时间被使用的，一致的重现性是困难的，有时甚至是不可能获得的。

Zui后通过的危险化学品的反复操作时的污渍和染色的制备过程中的增加的健康风险是人工染色的一个主要缺点。

图8A                                                          图 8B

图9A                                         图9B                     图9C

自动化反衬

徕卡EM AC20自动双对比的超薄切片装在格栅的传统手工技艺。 该技术的设计提供了一个解决方案，大多数人工染色的传统的问题，如沉淀和不相等的染色结果。 此外，通过同时对比高达20格，自动加速实验室程序和标准化的对比结果。 因此，用EM AC20全自动染色给出了一个广泛的重视改善的电子显微镜实验室常规通过省去了传统的染色问题，减少了对健康的危害，并给予技术人员的时间为更有价值的工作。

该仪器采用预包装的，稳定的乙酸双氧铀（UA）的溶液和柠檬酸铅染色，以尽量减少与危险的化学品，并消除了降水和污染控制和标准化污点制备和装瓶由于用户的接触（参见第2章）。 在Leica EM AC20的心脏是蠕动泵和非接触式的阀门系统，这意味着该试剂通过只是空气密封腔管行进。 该泵阀门，管件系统包含两个独立的管道设置窗口。 一个允许控制试剂的流和冲洗到炉栅室（图9b）。 第二引导废物从所述腔室到特定废液瓶。

影响因素对比

在染色技术，用在对比质量影响Zui大的因素是质量和染色溶液的浓度。 旁边的污渍，所述因素例如定香剂，缓冲剂，冲洗水，脱水，漂洗时间，包埋剂和聚合的程度以及切片厚度的类型影响的对比度也。

一般因素

固定剂

四氧化锇固定剂增强了对比度。 它可以作为固定剂，以及后染色过程中的对比度增强器通过用乙酸双氧铀和铅citrate.It已经表明，固定时间对由乙酸双氧铀的对比得到的对比度的效果相互作用。 长固定用四氧化锇减少如染色质的对比。 
 

缓冲器

双氧铀与二甲胂酸盐和磷酸盐离子可以导致铀酰盐沉淀强烈反应。 因此，无沉淀更高的对比度洗涤该样品固定后广泛时被获得。 
磷酸盐缓冲液可以保持甚至脱水和包埋后的组织，往往会引起小的，本地的，致密物沉积在肌肉和神经组织。 
 

冲洗水

在CO 2含量的漂洗水的影响通过形成碳酸铅沉淀的对比度。 新鲜蒸馏水的pH接近中性。 如果蒸馏水中静置的很长一段时间，CO 2从空气中溶解。 
此外，低pH <漂洗水中的6.0减小由醋酸双氧铀和因此也一般对比度给出的对比。 如果水的pH值低于6.0，加入KOH应为中和加入。 冲洗水也应脱气或煮沸以防止气泡其中，如果存在的话，附着在网格中的染色室和禁止染色的形成。 
 

包埋剂

的Epon和EPON的替代物已经被发现在相似的方式进行对比，因此，不需要特殊handling.Araldite已知，得到固有的背景染色。 因此，较短的对比时间在较低温度下是recommended.Spurr包埋树脂通常需要较长的时间的对比。 Zui好是不染色斯珀尔时提高温度，因为像的Araldite，树脂背景本身有一种倾向，占用嵌入试样的stain.The年龄是很重要的，因为包埋材料的聚合储存期间继续进行。 老标本和部分需要更长的醋酸铀对比时间。 
 

切片厚度

薄切片显示对比度比厚的部分，但更高的分辨率下，由于存在对污渍较少的位点被绑定到。 因此，薄的部分需要较长的染色时间比较厚的人。 
 

聚合级

聚合的不好包埋剂是软的，难以削减，占用污渍迅速。 因此，建议一个较短的对比时间在较低温度下进行。 
 

整块染色

试样的嵌入前对比已经成为近年流行的强化无沉淀物形成对比的方法。 
然而，“整块”染色本身并不提高试件的对比度足够的大部分研究。 同时与部分邮政染色，醋酸铀和柠檬酸铅建议在大多数教科书。